laura ortega torres: UNIDAD II

SEP SNEST DGEST

INSTITUTO TECNOLÓGICO DE CIUDAD ALTAMIRANO

UNIDAD II

TEMA:

Cultivo De Tejidos Vegetales

QUE PRESENTA:

LAURA ORTEGA TORRES

08930125

Carrera: LIC. Biología

Ciudad ALTAMIRANO, Gro. México. Febrero del 2012

INTRODUCCIÓN

En el presente curso de tecnología aplicada en la unidad 2 la cual se llama cultivos de tejidos vegetales se pretende estudiar las características de las plantas como es su estructura morfología las cuales se llevaran a cabo en el laboratorio en distintas áreas las cuales son las siguientes: Área de preparación de medios, área de lavado y esterilización, y área de rusticación .Los tejidos son un conjunto de células especializadas, en los vegetales encontramos diversos tejidos como los de conducción y los tejidos de crecimiento, en los tejidos de conducción es posible identificar al xilema y al floema. El xilema es un tejido de conducción cuya función es transportar agua y sales minerales (savia bruta) de la raíz a las hojas y demás órganos.

OBJETIVOS

El objetivo de esta unidad es conocer el laboratorio, material y equipo mínimo indispensable en la preparación de los medios de cultivo. Conocer las diferentes técnicas de esterilización y su importancia en el cultivo de tejidos vegetales. Conocer las características adecuadas para la selección, manejo de explante para la siembra, así como las condiciones de incubación.

METODOLOGÍA

El presente documento tendrá que ser publicando en este blogger de acuerdo alo que se vera en en clases , así como también las tareas que el profesor baya degando de acuerdo al programa , de igual manera las practicas de laboratorio.

2.1 MEDIOS DE CULTIVO

Un medio de cultivo consiste en un gel o una solución que cuenta con los nutrientes necesarios para permitir (bajo condiciones favorables de pH y temperatura) el crecimiento de virus, microorganismos, células o incluso pequeñas plantas.

Una placa de agar un ejemplo de crecimiento medio bacteriano.

Las líneas y los puntos naranjas son colonias bacterianas.

2. 1. 1. ÁREAS DEL LABORATORIO DE CULTIVO DE TEJIDOS

un laboratorio de cultivos de tejidos se puede dividir esquemáticamente en áreas separadas para las diferentes funciones que se desarrollan en la practica.

Las áreas o secciones principales son:

ÁREA DE PREPARACIÓN:
se utiliza principalmente para preparar los medios de cultivo, pero debe proveer un espacio para almacenar los materiales de vidrio y plástico, y los reactivos químico. este ambiente debe de contar con mesas de trabajo para la preparación de los medios y para colocar las balanzas , el medidor de ph,los platos calientes con agitacion y otros elementos; también deben incluir vitrinas, estanterías y espacio para el equipo de refrigeración, y para la incubadora o ala cámara de crecimiento( o para ambas ).

ÁREA DE LAVADO Y DE ESTERILIZACIÓN:
puede estar constituida por dos áreas conectadas entre si, o por un solo ambiente y puede estar localizada dentro del área general de preparación.

el área de lavado debe incluir por lo menos un lavadero grande con agua caliente y agua fría y una fuente doblemente destilada; para el efecto se debe usar un destilador de vidrio o de material no toxico y un desionizador de agua colocado entre el destilizador y el lavadero.

el área de esterilización bebe tener espacio para la autoclave vertical u horizontal, el cual puede ser pequeño (olla de presión) o grande ( de carga frontal y de enfriamiento lento y rápido), según sea el volumen del material que se procese.

ÁREA DE LAVADO

ÁREA DE ESTERILIZACIÓN

ÁREA DE TRANSFERENCIA:
en esta área de laboratorio se realiza el trabajo de escisión, inoculación y transferencia de los explantes a los medios de cultivo.dado que este trabajo demanda los mas altos niveles de limpieza ambiental,se recomienda la instalación de gabinetes de flujo horizontal o vertical de aire filtrado o ala construcion de cuartos de transferencia.

ÁREA DE INCUBACIÓN:
los cultivos se incuban en un cuarto apropiado o en gabinetes o en cámaras de crecimiento; estas pueden ser mas eficientes en cuanto al control ambiental, pero son mas costosas. el área de incubación crecimiento in vitro debe proporcionar un buen control de la temperatura(20-28 c) de la iluminacion.

ÁREA DE OBSERVACION Y EXAMEN:
generalmente los microscopios (estereo, compuesto invertido y otros) se localiza tanto en el area de incubacion como en la de transferencia pero opcionalmente pueden estar en un area separada. el objetivo de esta area es realizar observaciones periodicas de los cultivos, tanto en medios semisolidos como en liquidos.

ÁREA DE CRECIMIENTO:
las plantas que se regeneran en el area de incubacion se pueden acondicionar o aclimatar y luego trasplantar en macetas, bandejas o camas apropiadas. estas operaciones se pueden llevar acabo en tinglados, casas de malla o invernaderos dependiendo de las condiciones climaticas de lugar donde esta ubicado el laboratorio y de los requerimientos de aislamiento de los materiales por razones fotosanitarias.

ÁREA DE CUAREANTENA Y DE CONTROL FITOSANITARIO:
cuando la funcion de laboratorio es la produccion de materiales elites de sanidad certificada, se hace necesario contar con un area para la recepcion de las muestras o plantas destinadas, ala limpieza clonal , generalmente protegida contra insectos.

esta area de cuarentena debe estar separada del resto del laboratorio pero cercana al area de control fitosanitario.

ÁREA DE OFICINA:
en esta se debe ubicarel mobiliario de oficina como escritorios, archivos y almacenamiento de datos, los libros de referencia, y de control de laboratorio, los catalogos y otros documentos.

2.1.2 MATERIAL Y EQUIPO DE LABORATORIO

EL LABORATORIO DE CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES

BOTELLAS PARA REACTIVOS Y SOLUCIONES MADRE

PIPETAS, GOTEROS, PROBETAS Y MATRACES

Para la preparación de diversas soluciones para la elaboración de los medios básicos para el cultivo de tejidos vegetales se requiere de la cristalería siguiente:

Pipetas graduadas: de 1, 2, 5 y 10 ml

Goteros con pera de goma de 10 ml

Probetas graduadas: de 25, 50, 100, 250, 500 y 1000 ml

Matraces volumétricos: de 500 y 1000 ml

Matraces aforados: de 50, 100 y 250 ml

pipetas volumetricas

goteros

VASIJAS DE VIDRIO PARA LA DISTRIBUCIÓN DE MEDIO DE CULTIVO

Para la distribución de un volumen de medio de cultivo se pueden usar diferentes formas, por ejemplo vasijas de vidrio, embudos grandes con tubos de hule y pinzas de compresión, columnas de vidrio con boca de salida o botellas de inyección de Linger o simplemente recipientes de aluminio, como jarras.

JERINGAS DISPENSORAS

Cuando son volúmenes pequeños de medios de cultivo es muy efectiva la pipeta automática del tipo Cornwall. Esta pipeta está diseñada especialmente para el traspaso automático de dosis repetida de mediciones exactas y con capacidad para 10 ml.

MATERIALES

En la elaboración del equipo del laboratorio se utilizan los siguientes materiales:

Equipo básico de laboratorio 1

Equipo básico de laboratorio 2

La balanza granataria

Es uno de los instrumentos más utilizados en el laboratorio y su objetivo es determinar la masa de una sustancia o pesar una cierta cantidad de la misma.

El mecheroEl mechero es un instrumento de laboratorio de gran utilidad. Fué diseñado con el propósito de obtener una llama que proporcione máximo calor y no produzca depósitos de hollín al calentar los objetos.

Material más utilizado en un laboratorio de química

Material de madera	Material de plástico o goma
Gradilla	Gradilla
Mortero	Pipeta (química)
(utensilio)	Probeta (química)
	Propipeta
	Pera de succión
	Tapón
	Tubo de microcentrífuga

Material de vidrio	Material de metal
Alambique, Ampolla de decantación	Anillo de hierro
Cristalizador, Cuentagotas, Aparato de Kipp	Espátula
Embudo de decantación, Embudo de filtración, Matraz de Erlenmeyer	Gradilla
Kitasato, Matraz aforado	Pie universal
Placa de Petri, Pipeta (química)	Agitador magnético
Probeta (química), Retorta, Viscosímetro	Asa bacteriológica
Serpentín, Extractor Soxhlet	Autoclave
Tubo de ensayo, Tubo refrigerante (química)	Baño María
Varilla de vidrio (química), Tubo de desprendimiento (química), Vaso de precipitados	Centrífuga
	Mechero Bunsen, Termociclador

Material de porcelana	Instrumentos de medición
Crisol	Calorímetro
Mortero (utensilio)	Colorímetro
Embudo Büchner	Espectrómetro de transformada de Fourier^[
	Espectrómetro
	PH-metro
	RIFMA
	Densímetro

Material volumétrico	Instrumentos térmicos
Bureta	Calorímetro, Cámara infrarroja
Matraz aforado	Hipsómetro, Termómetro de máximas y mínimas
Micropipeta	Termómetro de Breguet, Termómetro de alcohol
Probeta (química)	Termómetro de bulbo, Pirómetro
Pipeta (química)	Termómetro de bulbo húmedo, Psicrómetro
	Termómetro de mercurio, Termómetro de resistencia
	Termómetro, Termistor, Termostato
	Termómetro de gas, Termoscopio

• Metales: Los más utilizados son el hierro y sus aleaciones, cobre, níquel, platino, plata y plomo. Con estos metales se fabrican soportes, pinzas, anillos, trípodes, triángulos, rejillas, sacacorchos, recipientes para agua, crisoles, espátulas, mecheros y electrodos, entre otros.

Se requieren muchas botellas de polipropileno de 50 ml, 100 ml, 500 ml para guardar soluciones madre o para hacer soluciones de varios reactivos. Las botellas oscuras son usadas para evitar la multiplicación de hongos y bacterias o oxidación causadas por la luz.

MATERIALES E INSTRUMENTAL

Para el desarrollo de la investigación y docencia, en el campo del cultivo de tejidos, se requieren de materiales que permitan la preparación de fórmulas nutrimentales con el objetivo de cultivar tejidos, órganos y células vegetales in vitro .

CRISTALERÍA

La cristalería de uso más común para el cultivo de tejidos se selecciona de la que se utiliza en experimentos químicos o de microbiología; sin embargo, poco de este material está diseñado especialmente por investigadores. Se utiliza bastante material de vidrio en la preparación de medio de cultivo y en la siembra de tejidos vegetales.

TUBOS DE ENSAYO

Se utilizan muy frecuentemente en cultivos con pequeñas cantidades de soluciones o bien para diversos tipos de medios. En cultivos que se mantienen en rotación o en agitación, para los medios líquidos, se utilizan tubos de ensayo, así como también en los medios sólidos. Los tubos de ensayo utilizados para cultivo de tejidos son más cortos y más anchos. Normalmente las dimensiones de los tubos de ensayo son de 2.0 x 15.0 cm, 2.5 x 15.0 cm o de 2.5 x 9.0 cm, aunque en el cultivo de órganos (experimentos sobre inducción de órganos) a partir del cultivo de tejidos y en la inducción floral se emplean tubos específicos que son de mayor longitud y diámetro (2.5 x 20.0 cm).

MATRACES ERLENMEYER

Estos matraces se usan para preparar medios de cultivo sólidos o líquidos; en la preparación de medios de cultivo. Se usan matraces de capacidad de 50, 125, 300 y 500 ml; de 1 y 2 litros dependiendo del volumen de trabajo, se tendrá la cantidad requerida de matraces. Para cultivo en matraces son más fáciles para su manejo los de 50 y 125 ml de capacidad; cuando los matraces y los tubos de ensayo tienen un mismo diámetro, se facilita más el hacer tapones para cubrirlos.

CAJAS DE PETRI

Las cajas de petri no sólo se utilizan para hacer cultivos en medios sólidos, también para germinar semillas esterilizadas o bien para esterilizar tapones de hule, filtros de nylon o de acetato de celulosa, que se usa para esterilizar soluciones orgánicas e inorgánicas y para guardar papel filtro.

BOTELLAS PARA CULTIVO

Para propósitos de cultivar plantas en condiciones in vitro, se utilizan botellas cilíndricas o cuadradas, que pueden ser las botellas de whisky, ron, brandy, etc., que son resistentes a altas temperaturas y que son muy apropiadas para los medios de cultivo sólido. Generalmente tienen una tapa rosca y se les puede conservar fácilmente en una posición vertical u horizontal. Las botellas cuadradas pueden colocarse unas sobre de otras, de tal forma que no ocupen mucho espacio, y las cilíndricas no requieren de canastillas especiales para guardarse. Uno de los recipientes más empleados para el cultivo de tejidos es el frasco para alimento de bebes (Gerber) que aparte de ser útil, es fácil de conseguir, muy barato y no ocupa mucho espacio en la cámara de incubación.

El floema también es un tejido de conducción que transporta la savia elaborada de las hojas a la raíz.En los tejidos de crecimiento encontramos a los primarios y secundarios, los tejidos primarios le dan crecimiento al vegetal en longitud estos son los meristemos primarios que los encontramos en en las puntas de las ramas, en las axilas de hojas y ramas y en las puntas de las raíces. Los tejidos secundarios los encontramos en el tronco o tallo de de las plantas, estos le dan un crecimiento al tallo en grosor aquí podemos encontrar al cambiun que es el responsable de “delatar” la edad de los arboles, a manera de que el tronco va ensanchando el cambium va dejando un anillo cuya marca representa un año de crecimiento, es decir en temporadas de lluvias que en muchos caos se da una vez por año, las plantas aprovechan para crecer, así que el tronco se ensancha una vez al año y cada vez que se ensancha el cambiun va dejando una marca en el tronco.

2. 1. 3. GENERALIDADES DE LOS

MEDIOS DE CULTIVO

Componentes de un medio de cultivo:

NUTRIMENTOS INORGANICOS

Los minerales son muy importantes en la vida de la planta; para un crecimiento sano y vigoroso se requiere de la presencia de compuestos inorgánicos que se agrupan en macro y micronutrimentos.

Según su cantidad

En función de la cantidad necesaria para las plantas y organismos, se clasifican en dos:

Macronutrientes

Se requieren en grandes cantidades diarias (habitualmente del orden de gramos). Estos nutrientes participan como sustratos en los procesos metabólicos. que todos en general necesitan para vivir mejor.

En nutrición, los macronutrientes son aquellos nutrientes que suministran la mayor parte de la energía metabólica del organismo. Los principales son glúcidos, proteínas, y lípidos. Otros incluyen alcohol y ácidos orgánicos. Se diferencian de los micronutrientes como las vitaminas y minerales en que estos son necesarios en pequeñas cantidades para mantener la salud pero no para producir energía.

La vida es sostenida por los alimentos, y las sustancias contenidas en los alimentos de las cuales depende la vida son los nutrientes. Estos proporcionan la energía y los materiales de construcción para las innumerables sustancias que son esenciales para el crecimiento y la supervivencia de las cosas vivas. Un nutriente es una sustancia usada para el metabolismo del organismo, y la cual debe ser tomada del medio ambiente. Los organismos no autótrofos (los heterótrofos) adquieren nutrientes a través de los alimentos que ingieren. Los métodos para la ingesta de alimentos son variables, los animales tienen un sistema digestivo interno, mientras que las plantas digieren los nutrientes externamente y luego son ingeridos. Los efectos de los nutrientes son dosis-dependiente.

Los nutrientes orgánicos incluyen glúcidos, lípidos y proteínas, así como vitaminas. Los componentes químicos inorgánicos como minerales, agua y oxigeno pueden también ser considerados como nutrientes. Un nutriente es esencial para un organismo cuando este no puede sintetizarlo en cantidades suficientes y debe ser obtenido de una fuente externa. Los nutrientes requeridos en grandes cantidades son llamados macronutrientes y los que son requeridos en cantidades más pequeñas se les conoce como micronutrientes.

Micronutrientes

Se requieren en pequeñas cantidades (habitualmente en cantidades inferiores a miligramos). Estos nutrientes participan en el metabolismo como reguladores de los procesos energéticos, pero no como sustratos. Son las vitaminas y los minerales.

Se conoce como micronutrientes a las sustancias que el organismo de los seres vivos necesita en pequeñas dosis. Son indispensables para los diferentes procesos bioquímicos y metabólicos de los organismos vivos y sin ellos morirían. Desempeñan importantes funciones catalizadoras en el metabolismo como cofactores enzimáticos, al formar parte de la estructura de numerosas enzimas (grupos prostéticos) o al acompañarlas (coenzimas). En los animales engloba las vitaminas y minerales y estos últimos se dividen en minerales y oligoelementos. Estos últimos se necesitan en una dosis aún menor.

En plantas son todos minerales. Se han podido estudiar bien en ellas gracias a cultivos sin suelo que pudiese alterar los resultados. Se han descubierto que algunos elementos se necesitan en proporciones tan bajas que un fertilizante que no los contenga en su formulación, puede aportarlos debido a las impureza que contiene. En algunos caso como el del sodio pueden ser aportados solo por tocar una hoja de una de una planta. El sudor de los dedos contiene suficiente sal y hace el efecto de un abono foliar.

Los micronutrientes no siempre necesitan ser aportados diariamente. La vitamina A y D o la B12 puede almacenarse en el hígado para cubrir las necesidades de periodos superiores al año. De hecho en países pobres se suministra a los niños una pastilla al año que cubre todas sus necesidades de vitamina A en ese periodo, por ejemplo. Idealmente, seria mejor sumistrales una dosis cada 6 meses.

En plantas algunos micronutrientes es suficiente con que se les suministre una vez en la vida. Simplemente con el contenido de él que hay en la semilla. Para que se produzca deficiencia se deberían cultivar varias generaciones en ausencia de ese mineral.

Algunos de los más importantes micronutrientes son el yodo, el hierro y la vitamina A que son esenciales para el crecimiento físico, el desarrollo de las funciones cognitivas y fisiológicas y la resistencia a las infecciones.

El hierro y la vitamina A se encuentran naturalmente en los alimentos y el yodo debe ser adicionado a alimentos de consumo básico como la sal que en muchos países y en Colombia se fortifica con yodo.

Existen otros micronutrientes como el zinc, el ácido fólico, el calcio y todas las vitaminas y minerales

Complementos orgánicos

Se consideran complementos microorgánicos a los compuestos orgánicos que se han llamado así por que el crecimiento y en general la morfogénesis se ven mejorado.

Los complementos microorgánicos se agrupan en:

vitaminas

Las vitaminas son precursoras de coenzimas, (aunque no son propiamente enzimas) grupos prostéticos de las enzimas. Esto significa, que la molécula de la vitamina, con un pequeño cambio en su estructura, pasa a ser la molécula activa, sea ésta coenzima o no.

Los requisitos mínimos diarios de las vitaminas no son muy altos, se necesitan tan solo dosis de miligramos o microgramos contenidas en grandes cantidades (proporcionalmente hablando) de alimentos naturales. Tanto la deficiencia como el exceso de los niveles vitamínicos corporales pueden producir enfermedades que van desde leves a graves e incluso muy graves como la pelagra o la demencia entre otras, e incluso la muerte. Algunas pueden servir como ayuda a las enzimas que actúan como cofactor, como es el caso de las vitaminas hidrosolubles

Las vitaminas son consideradas como factores alimenticios secundarios requeridos por los animales en pequeñas cantidades. Sin embargo, estas sustancias, que normalmente sintetizan las plantas, son también empleadas por ellas para su crecimiento y diferenciación con papeles catalíticos en el metabolismo. Cuando las células de plantas superiores son cultivadas in vitro , las vitaminas son necesarias para el crecimiento llegando a ser su ausencia o nivel de concentración, un factor limitante. No obstante, estas necesidades dependerán de la especie. Las vitaminas que son adicionadas más usualmente como parte del medio sintético son: tiamina-HCl, ácido nicotítico, piridoxina-HCl, biotina, ácido fólico, ácido pantoténico, riboflavina

clasificación de vitaminas

Las vitaminas se pueden clasificar según su solubilidad: si lo son en agua hidrosolubles o si lo son en lípidos liposolubles. En los seres humanos hay 13 vitaminas que se clasifican en dos grupos: (9) hidrosolubles (8 del complejo B y lavitamina C) y (4) liposolubles (A, D, E y K).

Tiamina (B1)

La Tiamina es esencia para el crecimiento. Es fotoestable, pero durante la esterilización por autoclave se descompone en pirimidina y tiazol; sin embargo, la mayoría de los tejidos son capaces de sintetizar tiamina a partir de los productos de su descomposición. En la naturaleza, especialmente los cereales aparecen libre y en concentraciones relativamente elevada.

Piridoxina (B6)

Es termo y fotoestable. Se localiza en semillas de cereales y no se considera esencial para la mayoría de las plantas in vitro.

Quizá el papel más importante en su participación, bien conocida, en la síntesis de purinas y pirimidinas y por lo tanto en el metabolismo de los ácidos nucleicos.

Acido nicotinico

También se le llama niacina. Es foto y termoestable. Su principal función es ser coenzima de las enzimas que se conoce como deshidrogenasas que catalizan las reacciones de oxido-reducción (NAD, NADP Y NADH o NADPH).

2. 1. 4. COMPONENETE DEL
MEDIO DE CULTIVO

Componentes De Los Medios De Cultivo

Los componentes de un medio de cultivo dependen del microorganismo que se pretende cultivar y de la finalidad del cultivo. A continuación se describe que es general la necesidad de utilizar :agua, sustancias orgánicas y sustanciasinorgánicas. Los medios de cultivo sólidos llevan además un agente solidificante

2.1.5. Preparación y manejo de soluciones stock

2. 1. 6. PREPAPARACION DE LOS

MEDIOS DE CULTIVO.

los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Se han preparado más de 10.000 medios de cultivo diferentes.

Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presión de oxígeno adecuadas, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo contaminante.

La mayoría de las bacterias patógenas requieren nutrientes complejos similares en composición a los líquidos orgánicos del cuerpo humano. Por eso, la base de muchos medios de cultivo es una infusión de extractos de carne y Peptona a la que se añadirán otros ingredientes.

El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparación de medios de cultivo. Se licúa completamente a la temperatura del agua hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40 grados. Con mínimas excepciones no tiene efecto sobre el crecimiento de las bacterias y no es atacado por aquellas que crecen en él.

La Gelatina es otro agente solidificante pero se emplea mucho menos ya que bastantes bacterias provocan su licuación.

En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales de enriquecimiento como hidratos de carbono, suero, sangre completa, bilis, etc. Los hidratos de Carbono se adicionan por dos motivos fundamentales: para incrementar el valor nutritivo del medio y para detectar reacciones de fermentación de los microorganismos que ayuden a identificarlos. El suero y la sangre completa se añaden para promover el crecimiento de los microorganismos menos resistentes.

También se añaden colorantes que actúan como indicadores para detectar, por ejemplo, la formación de ácido o como inhibidores del crecimiento de unas bacterias y no de otras (el Rojo Fenol se usa como indicador ya que es rojo en pH básico y amarillo en pH ácido. La Violeta de Genciana se usa como inhibidor ya que impide el crecimiento de la mayoria de las bacterias Gram-positivas).

2.2 ESTERELIZACION

La esterilización es un método del control del crecimiento microbiano que involucra la eliminación de todas las formas de vida, incluidos virus y esporas. Es un término absoluto que implica la pérdida de la viabilidad mediante la destrucción de todos los microorganismos contenidos en un objeto, área específica o sustancia, acondicionando de tal modo la posterior propagación o contaminación a otros objetos o al medio ambiente.

Los agentes que matan microbios son denominados microbiocidas (cida= “matar”) o más comúnmente denominados “germicidas”. Si el agente específicamente destruye bacterias, es llamado bacteriocida; si mata hongos es denominado fungicida. Como sea después de exponer el objeto esterilizado al aire o a sus alrededores, éste otra vez se habrá contaminado con microorganismos.

Se trata de un término probabilístico, de modo que tras un adecuado proceso de esterilización, se debe llegar a una probabilidad de encontrar microorganismos igual o menor que una unidad contaminada en un millón de unidades sometidas a un proceso de esterilización.

Los métodos térmicos de esterilización son comúnmente los más utilizados para matar microorganismos, incluyendo las formas más resistentes como lo son las endoesporas.

2. 2.1. Tipos de esterilización

Tipos de esterilización
1.- Calor seco
2.- Vapor
3.- Llama directa u horno de aire caliente
4.- Calor húmedo
5.- Ebullición
6.- Vapor y Autoclave
7.- Productos químicos
8.- Filtración.

Calor Húmedo

El calor húmedo produce desnaturalización y coagulación de proteínas. Estos efectos se deben principalmente a dos razones:

El agua es una especie química muy reactiva y muchas estructuras biológicas (DNA, RNA, proteínas, etc) son producidas por reacciones que eliminan agua. Por lo tanto, reacciones inversas podrían dañar a la célula a causa de la producción de productos tóxicos. Además, las estructuras secundarias y terciarias de las proteínas se estabilizan mediante uniones puente de hidrógeno intramoleculares que pueden ser reemplazadas y rotos por el agua a altas temperaturas.

El vapor de agua posee un coeficiente de transferencia de calor mucho más elevado que el aire. Por lo que, los materiales húmedos conducen el calor mucho más rápidamente que los materiales secos debido a la energía liberada durante la condensación.

El autoclave es el aparato más comúnmente utilizado en los laboratorios para esterilizar cultivos y soluciones que no formen emulsiones con el agua y que no se desnaturalicen a temperaturas mayores a 100 °C. Una temperatura de 121 °C (una atmósfera de sobrepresión) con un tiempo de exposición mayor a 15 minutos sirve para destruir organismos formadores de esporas.

AUTOCLAVE

El calor seco produce desecación de la célula, efectos tóxicos por niveles elevados de electrolitos, procesos oxidativos y fusión de membranas. Estos efectos se deben a la transferencia de calor desde los materiales a los microorganismos que están en contacto con éstos. El aire es mal conductor del calor, y el aire caliente penetra más lentamente que el vapor de agua en materiales porosos. La acción destructiva del calor sobre proteínas y lípidos requiere mayor temperatura cuando el material está seco o la actividad de agua del medio es baja. Esto se debe a que las proteínas se estabilizan mediante uniones puente de hidrógeno intramoleculares que son más difíciles de romper por el calor seco.

La estufa de esterilización es el artefacto utilizado en los laboratorios para esterilizar por calor seco. Se requiere mayor temperatura y tiempo de exposición que el autoclave. La temperatura varía entre 120° y 180°C, requiriéndose distintos tiempos de exposición. A 140°C se necesitan por lo menos 5 horas de exposición, mientras que a 160°C se requieren al menos 2 horas de exposición.

Esterilización con vapor de agua

La esterilización mediante vapor de agua a presión es un método universalmente aceptado. Se

emplea para todos los materiales excepto para aquellos que puedan resultar dañados por el calor o por la humedad. Implica el calentamiento de agua hasta que se genera vapor de agua en una cámara cerrada, de forma que al irse llenando la misma, el vapor desplace el aire al exterior, a través de una válvula de escape. Posteriormente se cierra la válvula permitiendo, así, que la presión vaya aumentando y que se alcancen temperaturas superiores a los 100º C.
El fundamento consiste en que las partículas de vapor al condensarse sobre la superficie, más fría, de los instrumentos transmiten su energía y calor a éstos, el espacio ocupado por esas moléculas de vapor que se condensan vuelve a ser ocupado por más vapor, que volverá a condensarse transmitiendo al instrumental su energía calórica y este proceso que es muy rápido continúa hasta que los instrumentos puestos en la cámara alcanzan la temperatura del vapor

La esterilización por calor tiene cuatro fases:

Extracción del aire

Dado que la presencia de aire en la cámara es uno de los principales factores, si no el principal, que impide la eficiencia del proceso de esterilización, es muy importante que el aire sea adecuadamente

expulsado al exterior de la misma. Las principales técnicas para expulsar el aire son:

- desplazamiento por gravedad.

- por vacío, es el más utilizado y el que permite una esterilización más rápida.

En los de tipo gravitatorio el aire se elimina, tanto de la carga de material como de la cámara, al

ser desplazado hacia abajo por el vapor que va entrando en la cámara, ya que el aire es más pesado que este, y sale del esterilizador por una válvula de drenaje.

Calor seco.

El fundamento de este método estriba en calentar el aire de modo que a partir de este se lleve a

cabo una transferencia de calor al instrumental que se pretende esterilizar.

El calor seco al tener menos capacidad de penetración y de transferencia del calor que el calor

húmedo, requiere mas tiempo para conseguir la esterilización.

ESTERILIZACIÓN QUÍMICA

Esterilización con óxido de etileno y otros gases

El gas óxido de etileno es el gas más utilizado en los hospitales para esterilizar materiales que por su naturaleza, no pueden ser sometidos a la acción del calor. Este gas se utiliza a temperaturas relativamente bajas que no funden, como ocurriría en la esterilización por calor, los artículos de goma y de plástico. Entre los inconvenientes que presenta cabe señalar: la larga duración del proceso de esterilización y, muy especialmente, de la necesaria ventilación posterior del material con el fin de

desplazar los restos de óxido de etileno que pudiese quedar en el mismo, así como el que se debe manejar adecuadamente ya que puede resultar explosivo.

Esterilización por plasma (plasmagas)

Este método se basa en la formación de un plasma primario de peróxido de hidrógeno H2O2 ó

agua oxigenada) por medio de una alta frecuencia. En la fase de plasma se necesitan cantidades
relativamente bajas de peróxido de hidrógeno para matar a los microorganismos, con lo que se evitan los fenómenos de corrosión que se presentan utilizando cantidades elevadas.

CONTROL DE LA ESTERILIZACIÓN

Los procesos de esterilización deben ser sometidos de modo rutinario a controles que

demuestren su eficacia, los cuales pueden ser de tres tipos:

- físicos

- químicos

- biológicos

Se deben utilizar las tres formas de control:

a) Controles físicos: consisten en un registro de presión, temperatura y tiempo. Si se aprecia

alguna anomalía en estos parámetros la carga no puede ser considerada estéril, y tras la
necesaria revisión del equipo deberá procederse a un nuevo control de verificación.

b) Controles químicos: sirven para detectar anomalías en el proceso de esterilización, pero es

importante señalar que no sirven para garantizar la esterilidad del material. Si el control
químico no ha virado correctamente se debe reprocesar el material que fue sometido al ciclo
de esterilización en cuestión. Actualmente se dispone de controles integrados que permiten
comprobar que las condiciones físico-químicas (temperatura, humedad, presión,
concentración del agente esterilizante) se han alcanzado durante el tiempo necesario para
ejercer su acción.

2.2.2. Factores que intervienen en el proceso de esterilización.

METODOS DE ESTERILIZACIÓN

Un material es considerado estéril cuando la probabilidad de supervivencia de cualquier microorganismo en el mismo es inferior a una entre un millón.

Los más utilizados son:
Químicos (gases de óxido de etileno, entre otros)

Físicos (calor húmedo o autoclave, calor seco o estufa)
Irradiación (rayos gamma o ultravioletas)
A bajas temperaturas (Formaldehído, Ácido Peracético, Peróxido de hidrógeno, etc)
Por filtración (filtros EPA)

METODOS QUÍMICOS
Oxido de Etileno
Es un gas incoloro e inodoro cuyas especiales propiedades químicas le permiten buena difusión en los materiales porosos, buena difusión y absorción en la mayoría de los plásticos termosensibles, no reacciona ni deteriora la mayoría de los materiales que constituyen los elementos a esterilizar por este método lo que permite su uso sin riesgo. Se utiliza entre los 25 º C y los 55 º C garantizando la no deformación o destrucción de los elementos a esterilizar. Traspasa las membranas de las empaquetaduras que contienen los elementos, en especial el film de polietileno.

MECANISMO DE ACCION: Actúa como agente alquilante, provocando una modificación irreversible en enzimas e inhiben la actividad su actividad. Es activo contra todo tipo de bacterias, incluyendo esporas bacterianas, virus y bacilos tuberculosos.

EFECTOS ADVERSOS:

Es altamente tóxico para los seres vivos, pudiendo provocar reacciones locales sobre piel y mucosas y efectos tóxicos sistémicos con manifestaciones clínicas como disnea, cianosis, trastornos gastrointestinales, hemólisis, necrosis.

MÉTODOS FÍSICOS

Calor: La utilización de este método y su eficacia depende de dos factores: el tiempo de exposición y la temperatura.
Todos los microorganismos son susceptibles, en distinto grado, a la acción del calor. El calor provoca desnaturalización de proteínas, fusión y desorganización de las membranas y/o procesos oxidantes irreversibles en los microorganismos.

Calor Húmedo (autoclave):
El calor húmedo produce desnaturalización y coagulación de proteínas. Estos efectos se deben principalmente a dos razones:
El agua es una especie química muy reactiva y muchas estructuras biológicas son producidas por reacciones que eliminan agua.
El vapor de agua posee un coeficiente de transferencia de calor mucho más elevado que el aire.
Los materiales deberán disponerse de tal manera que se asegure el intimo contacto de todas sus partes con el vapor. Ej.: pinzas abiertas, jeringas desensambladas, etc.

Se realiza la esterilización por el vapor de agua a presión. El modelo más usado es el de Chamberland.
Esteriliza a 120º a una atmósfera de presión (estas condiciones pueden variar) y se deja el material durante 20 a 30 minutos.

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FACTORES QUE AFECTAN A LOS DESINFECTANTES

Los factores que se estudian influyen en la capacidad de los desinfectantes químicos para actuar sobre os microorganismos, así como la duración de esta acción. CONCENTRACIÓN	TIEMPO	TEMPERATURA	PH	ESTADO DE VIDA Y CLASE DE MICRO ORGANISMO
Varia de un microorganismo a otro y de un desinfectante a otro; uno demasiado concentrado puede originar la coagulación en la superficie de las materias orgánicas e impide la penetración del producto en el interior de la bacteria y puede ser irritante, corrosivo y costoso. Por el contrario, un producto es menos activo cuanto más diluido está. Es imprescindible emplear las concentraciones recomendadas.	La desinfección es un proceso gradual que requiere tiempo para consolidarse, el desinfectante ha de permanecer en contacto con el material contaminado el tiempo suficiente para que sea efectivo.	A altas temperaturas se incrementa la acción bacteriana. La mayoría se llevan a temperatura ambiente.	En la interacción de los desinfectantes con los microorganismos es importante la acidez y la alcalinidad del medio, y pueden aumentar o disminuir su acción. Para cada producto debe considerarse por separado la acción del pH	Existen en los microorganismos algunas variaciones en la susceptibilidad, se clasifican en los tres grupos: GRUPO A: Formas vegetativas y virus con cubierta que se destruyen fácilmente con los productos. GRUPO B: Los más difíciles de destruir, GRUPO C: Esporas bacterianas y virus resistentes, entre ellos los que causan la hepatitis.
ACCESIBILIDAD DE LAS BACTERIAS	NUMERO DE BACTERIAS A ELIMINAR	PRESENCIA DE SUSTANCIAS EXTRAÑAS	EXPOSICIÓN ADECUADA	DETERIORO DEL DESINFECTANTE
Para que el producto sea efectivo debe alcanzar la célula bacteriana; de no hacerlo su utilización es inútil. Mecanismo de Acción: 1.- Absorción superficial por coloides proteicos Unión del producto a grupos activos de las proteínas extrañas2.-	A mayor numero se debe incrementar el tiempo de exposición	La tierra, sangre y pus pueden reaccionar con algunos desinfectantes y disminuir su capacidad para interactuar con los microorganismos. Debe limpiarse bien el área que se ha de desinfectar	Se debe asegurar que todas las áreas a desinfectar tengan una exposición adecuada al producto (envases cerrados)	Siempre deben reemplazarse depuse del segundo dia ya que se deterioran progresivamente

2.3. Establecimiento El Cultivo De Tejidos

En su acepción amplia, el cultivo de tejidos vegetales se define como un conjunto muy heterogéneo de técnicas que presentan en común el hecho de que un explanto —o sea, una parte separada del vegetal, tales como protoplastos, células, tejidos u órganos— se cultiva asépticamente en un medio artificial de composición química definida y se incuba en condiciones ambientales controladas. Estas técncias pueden ser utilizadas en vegetales como herramientas para micropropagación, propagación rápida de clones, eliminación de virus y enfermedades, producción de haploides, aislamiento y utilización de protoplastos, cultivo de embriones, producción de fitoquímicos, ingeniería genética, mutación y selección celular, producción de semillas sintéticas y estudios básicos de anatomía, desarrollo, fisiología y nutrición vegetal.

El cultivo de tejidos se inicia con la disección microscópica de la planta bajo condiciones estrictamente higiénicas con el propósito de transferir un tejido que crece activamente (los tejidos meristemáticos) con seguridad y limpieza dentro de un recipiente estéril sin introducir microorganismos contaminantes. Las células y tejidos que crecerán y se desarrollarán a partir del explanto original depende de los objetivos del cultivo de tejidos. En algunos casos las células conformarán una masa aparentemente desorganizada, conocida como callo, en otros estarán presentes otras estructuras reconocibles como tallos, raíces, bulbos u otros órganos. Estos tejidos cultivados in vitro se hallan dentro de un microcosmos estéril de un recipiente de vidrio o de plástico, protegidos del medio exterior no estéril. Es esencial mantener la esterilidad del medio ambiente confinado en el recipiente, debido a que cualquier microorganismo que se gane la entrada al mismo crecerá oportunísticamente a una velocidad mucho más rápida que los tejidos vegetales y eventualmente colonizarán y matarán a los tejidos. Con el propósito de sostener el vigor de los tejidos vegetales y permitir que ellos crezcan, se multipliquen y desarrollen, esto es «cultivar los tejidos», deben proveerse además ciertos requerimientos externos. Los tejidos pueden necesitar que se los apoye o sean colocados sobre o en el interior de la superficie de un gel acuoso solidificado con agar o pueden colocarse en un medio líquido. Los tejidos también necesitarán de un suministro de los elementos minerales nutritivos que son esenciales para el crecimiento vegetal, también posiblemente algunas vitaminas, azúcares como fuente de energía y una mezcla de hormonas vegetales que se conoce que controlan el crecimiento y desarrollo de estos tejidos particulares. Para el correcto crecimiento y desarrollo del tejido en cultivo en general es necesario el suministro de luz a intensidades muy bajas, mucho menores que la de la luz solar. La acumulación en las plantas de la energía de los carbohidratos provendrá de los azúcares agregados al medio de cultivo, más que de la fotosíntesis, de manera que son innecesarios altos niveles de luz.

Estos tejidos cultivados in vitro se hallan de un microcosmos estéril de un recipiente de vidrio o de plástico , protegidos del medio ambiente confinado en el recipiente debido que cualquier microorganismo que se gana la entrada al mismo crecerá a una velocidad mas rápida que los tejidos vegetales y eventualmente colonizaran y mataran a los tejidos .con el propósito de sostener el vigor de los tejidos vegetales y permitir que ell crezcan se multipliquen y desarrollen , esto es ( cultivar los tejidos)

2.3.1. Etapas del cultivo de tejidos

Etapas del procesoEl cultivo de tejidos vegetales es el proceso que se inicia con un explanto y termina con la obtención de plantas completas, lo que involucra una serie de etapas, las cuales se enumeran a continuación

Elección de la planta y/o tejido donante de explantos. En esta fase se incluyen los tratamientos, preparación y selección de las plantas madre a partir de las cuales se inicia el cultivo, siendo imprescindible comprobar la identidad (especie, variedad o cultivar) y su estado de salubridad (libre de patógenos, deficiencias o estrés).

Establecimiento: consiste en la desinfección de los explantos (generalmente con hipoclorito de sodio) y su posterior adaptación al medio artificial de modo de inducir callo, brote, raíz o embrión somático, según se desee. Se requiere desinfectar superficialmente el material escogido para evitar que en el medio de cultivo crezcan microorganismos, principalmente bacterias y hongos, que competirán ventajosamente con el explanto

Multiplicación: consiste en generar una cantidad de masa vegetal suficiente para la regeneración del número de plantas necesarias.

Enraizamiento: es el proceso de inducción de la formación de raíces con el fin de convertir alos brotes o embriones somáticos en plántulas completas. El enraizamiento puede realizarse tanto en condiciones in vitro como ex vitro. En el primer caso se transfieren los brotes obtenidos en la etapa anterior a un medio libre de reguladores de crecimiento o que sólo contenga auxinas. Esta operación se realiza en condiciones de esterilidad (en cabina de flujo). En el segundo caso los brotes se sumergen en una solución concentrada de auxinas y se transfieren a un sustrato limpio, no necesariamente estéril, que puede ser una mezcla de turba con perlita o vermiculita. Los brotes que se utilicen en el enraizamiento ex vitro deben ser vigorosos y poseer hojas bien desarrolladas, ya que las plantas deben realizar la fotosíntesis para obtener la energía necesaria para desarrollarse y formar las raíces.

de plantas superiores

El proceso de micropropagación de especies vegetales consta de varias etapas

ETAPA 1 : Elección de una planta madre selecta Explantos Desinfección superficial
ETAPA 2: Transferencia a un medio de multiplicación Formación de brotes o embrioides
ETAPA 3: Transferencia a un medio para el enraizamiento de los brotes
ETAPA 4: Pasaje a maceta en un invernáculo

2.3.2. Selección de plantas madres

SELECCIÓN DE LAS PLANTAS MADRE

La selección de plantas madres orientada a la producción de clones de calidad es una búsqueda que requiere algo de dinero, tiempo y paciencia, pero que se ve recompensada con una producción continua de clones 100% hembra de primera calidad y de buena hierba.
El sistema es sencillo aunque dependiendo de la variedad elegida, índica o sativa, del número de semillas que pensemos germinar y el precio de estas, nuestra inversión puede dispararse un poco. Por este motivo, cuando muchos cultivadores hacen los cálculos correspondientes tanto del gasto (se necesitan dos cuartos de cultivo, uno para crecimiento y otro para la floración, semillas, luz, tierra, abonos, material para hacer esquejes...) como del tiempo que les puede llevar hacer una selección (entre cuatro y cinco meses de media sí el proceso parte desde semilla), muchos optan por comprar un lote de buenos esquejes para seleccionar los mejores y hacerse así una madre decente, pues como hemos dicho antes, también se pueden obtener plantas madre a partir de esquejes de calidad (aunque estos sean esquejes de otros esquejes). Os aconsejamos encarecidamente que antes de hacer esto pidáis permiso a la persona "propietaria" de esa genética (a la que se los compráis o pedís), sobre todo si es un conocido. Pues para muchos cultivadores, sus "niñas" son sagradas y puede que no vean estas prácticas con buenos ojos.

Una buena solución para evitar que os "roben" una genética seleccionada es pasar o regalar siempre los esquejes o clones cuando estos ya han empezando a florar (aunque tengamos que forzar un poco el fotoperiodo) y muestren algún pistilo. De este modo será necesario el reflorarlos para inducirlos de nuevo al crecimiento y perderán gran parte de su vigor y su productividad quedando a salvo nuestra valiosa genética.

La Selección

La primera elección que debemos hacer es la de la variedad de planta que queremos cultivar y los rasgos concretos que buscamos en ella, como el vigor, la rapidez en el crecimiento, la producción de cogollos, la resistencia a enfermedades (sobre todo a hongos y mohos), el efecto al fumarla, y el sabor. Aunque debemos fijarnos también en otras características como su producción de tallos verdes, la fuerza y el vigor de las ramas de nuestras plantas o la facilidad para enraizar que tienen estas ramas.

La selección básicamente consiste en germinar de uno a dos paquetes de semillas, como media, de la variedad de nuestra elección, hacer un par de esquejes de cada fenotipo, cultivarlos y fumarlos para elegir de entre todas esas plantas, las hembras más fuertes, vigorosas, productivas, resistentes y sabrosas. En definitiva, seleccionar las mejores plantas hembra del conjunto para obtener de ellas una producción continuada de esquejes de calidad. En realidad podemos germinar todas las semillas que queramos ya que a más semillas sembradas más probabilidades tendremos de dar con alguna planta que tenga las características deseadas.

En principio, cualquier planta hembra, ya sea cultivada desde semilla o sea el esqueje de otro esqueje, e independientemente de su edad y estadio de desarrollo, puede convertirse en una planta madre. Aunque es importante recalcar que los mejores resultados se obtienen de plantas hembras sanas y seleccionadas por sus especiales características, con al menos dos meses de edad, y que no hayan sido refloradas. Las plantas hembras que han sido inducidas a florar y después a revegetar producen menos esquejes y de peor calidad, débiles y de lento enraizado. También se puede dar una degeneración si las plantas madre están infectadas por algún virus o por alguna enfermedad u hongo. No uséis nunca plantas enfermas, revegetadas o con estrés, ni ejemplares vulgares como plantas madre. Seleccionar solo aquellas plantas o esquejes sanos que muestren alguno de los rasgos antes mencionados, pues los esquejes que obtengamos a partir de estas serán idénticos a sus progenitoras, tanto para lo bueno como para lo malo.

2.3.3. Explante

Los explantes son de diversa naturaleza, pueden ser porciones de tejido, células sueltas, protoplastos, esporas, granos de polen o semillas (Fossard 1999). El tipo de explante a usarse en los procesos de micropropagación depende de la especie con la que se esté trabajando y de los objetivos que se persigan. Explantes como los meristemos apicales y las yemas axilares son genéticamente muy estables, este tipo de explantes sirve para reproducir múltiples clones de una forma o variedad con características especiales que se desea mantener en el cultivo. Otros explantes como las yemas adventicias son mas bien genéticamente inestables y producen un alto grado de variabilidad en los clones, este procedimiento no es útil para la producción de plántulas con una determinada característica de cultivo, pero si lo es para el fitomejoramiento, ya que mediante esta variación semi–natural, es posible obtener nuevas líneas de cultivo.

Una vez que se ha obtenido el explante, este debe ser correctamente desinfectado para evitar la proliferación de contaminantes biológicos (bacterias, hongos y levaduras principalmente) en el medio, los cuales afectan el crecimiento y desarrollo del explante (Fontúrbel 2001) y compiten con el mismo deteriorándolo y haciéndolo inservible para cultivo (Kyte & Kleyn 1996).

Los explantes desinfectados son trasladados a una cámara de flujo laminar (con aire filtrado, libre de microorganismos) donde se realizará la transferencia a un medio de cultivo apropiado (Kyte & Kleyn 1996) al tipo de especie y las necesidades del cultivo. Una vez que el explante está en el medio, se sella el rasco de cultivo y se traslada a una cámara de crecimiento con condiciones de humedad, temperatura y fotoperiodo controladas para su desarrollo.

Una vez que los explantes –luego de algunas semanas en la cámara de crecimiento– han desarrollado algunas raíces y hojas, es el momento de realizar el traspaso al invernadero. Este es uno de los pasos más difíciles de la técnica, ya que los explantes in vitro se encuentran en condiciones ambientales muy diferentes y se alimentan de manera heterotrófica (del medio de cultivo) y el estrés de adaptación a las condiciones de vivero es muy fuerte (Kyte & Kleyn 1996, Fossard 1999). Un porcentaje de las plántulas clonadas in vitro no sobrevive al invernadero, pero la parte que si sobrevive crece –ya en condiciones normales– y al cabo de una semanas está lista para ser trasladada al campo de cultivo.

Explantes regenerados

El cultivo

de meristemas se utiliza en muchas especies para la erradicación de virus y restaurar la sanidad de los materiales para la producción. La termo y la quimioterapia son técnicas que solas o en combinación con el cultivo de meristemas también se utilizan para este fin. El objetivo del presente estudio fue establecer una metodología que permitiera la regeneración de plantas a partir del cultivo de meristemas de chayote y evaluarla como medio para la limpieza del virus del mosaico del chayote en plantas infectadas. Para estas pruebas se utilizaron dos tamaños de explante y se evaluó el efecto de varios reguladores de crecimiento adicionados al medio de cultivo Murashigue y Skoog sobre la formación de plántulas. En los clones evaluados, la adición de 0,10 mg L tipos de explantes utilizados. La termo y quimioterapia aplicadas a vitroplantas y meristemas, respectivamente, afectaron negativamente el desarrollo de los explantes y no permitieron su regeneración. Con la incubación de brotes de chayote en Ribavirina (virazol) se logró la erradicación del virus, pero las plántulas regeneradas mostraron poco crecimiento, amarillamiento y poco o ningún desarrollo de raíces.

2.3.4. Siembra del explante

Se preparan y esterilizan previamente las cosa que se utilizaran en la cámara de flujo laminar (papel, algodón, bisturí, agua destilada, medios de cultivo).

se retira la tapa de la cabina de flujo laminar y se enciende la misma. Se limpian los frascos con medio de cultivo para ingresarlos a la cabina (la limpieza es con alcohol antiséptico y algodón esterilizado.

atomizacion de alcohol en la mesa de trabajo.

Se limpia la mesa de trabajo de la cabina con alcohol antiséptico y algodón estéril. Se atomiza alcohol sobre el frasco con los esquejes en cloro, los frascos con cisteína y recipientes vacíos, para luego secarlos con algodón esterilizado. Se enciende el mechero de alcohol.

Se flamea el soporte de los instrumentos (tapa de caja petri), el bisturí y la pinza, para luego atomizar alcohol industrial sobre parte de la mesa y flamearla también.

Flameacion de las pinzas, caja petri y mesa de trabajo respectivamente.

Transcurrido el tiempo de los esquejes en cloro, se ciernen los mismos y con agua destilada esterilizada se procede a lavarlos varias veces, para retirar todo rastro de cloro. Se vuelven a sumergir los esquejes en agua destilada y se colocan tres gotas de cloruro de mercurio, se agita fuertemente y se escurre el agua, se lava varias veces con agua destilada esterilizada y se escurre.

adicion del cloruro de mercurio.

Se limpia la mesa de trabajo con un algodón esterilizado y alcohol industrial. Se extiende un papel esterilizado en la mesa de trabajo y se colocan sobre este los explantes.

Manejo de los esquejes antes del corte a explante.

Con la ayuda de una pinza, se sujeta el esqueje para que con un bisturí se pueda realizar el corte del mismo.

Corte del explante. abaj) explante o inoculo

Una vez cortados, con la ayuda de una pinza se colocan los explantes en los frascos con agua con cisteína, hasta que se termine de preparar todos los explantes.

Se retira el papel usado y se limpia la mesa con alcohol y algodón esterilizado, antes de extender otro papel limpio.

Explantes inmersos en cisteina.

Cuando al fin se ha terminado de realizar todos los cortes, se acercan los frascos con medio de cultivo. Se extiende un papel esterilizado y con ayuda de una pinza se sacan los explantes inmersos en cisteína para colocarlos sobre el papel. Se abre suavemente la tapa del frasco con medio esterilizado. Se flamea la pinza y se deja enfriar un poco.

Proceso de siembra de los explantes.

Con la pinza se coge el explante y se lo deposita en el medio, este no debe quedar totalmente sumergido en el medio. Se tapa nuevamente el frasco y se ajusta hasta terminar de sembrar todos.

Explante sembrado de forma adecuada y acostado respectivamente.

Cuando se termina de sembrar todos los explantes, se retiran de la cabina de flujo laminar y se apaga la misma, luego se envuelve en plástico strech film cada uno de los frascos. Paar finalizar se llevan los frascos a un area esteril y sin luz por 8 dias, despues de esto se retiran los contaminados y se lleva el resto a estanterias con tubos de luz fluorescente.

Sellado de los frascos sembrados.

2.3.5. Condiciones de incubación

v Iluminación: composición espectral, irradiación, fotoperiodo

v Temperatura

v Humedad

v Disponibilidad de Agua

v Ventilación

v Otros

Condiciones de incubación. Los experimentos para la determinación de viabilidad, desarrollo, porcentaje y tiempo de germinación, se llevaron a cabo utilizando cajas de petri (100 x 15 mm) previamente preparadas con papel filtro Núm. 541, humedecido con agua destilada esterilizada al momento del establecimiento de las semillas, preparadas de acuerdo a los diferentes experimentos establecidos; una vez que las semillas fueron sembradas, las cajas de petri se sellaron y colocaron en cuarto de incubación a fotoperiodo de 16 h y flujo fotónico de 33.78 μm·m^–2·s^–1 en las diferentes temperaturas probadas para cada uno de los experimentos.

2.3.6. Cambios fisiológicos del explante

2.3.7. Trasplante al sustrato

La creciente trasplantes de vegetales para la producción de vegetales orgánicos es equivalente a la creciente los trasplantes de vegetales para la producción convencional. Todos los trasplantes de vegetales requieren limpiar las condiciones de crecimiento, la luz y el calor adecuado, así como de crecimiento no contaminados los medios de comunicación y agua potable. Sin embargo, para la producción vegetal orgánica es imperativo utilizan sustrato de cultivo que ha sido aprobado por la Revisión de Materiales Orgánicos Institute (OMRI). Además, la fuente de semillas y / o material de plantas, fertilizantes y herramientas de manejo de plagas debe ser OMRI aprobada

Sustratos de cultivo

Sustrato de cultivo es la base de plántulas sanas. Un sustrato creciente de que es

limpio, libre de enfermedad y cuenta con espacios para el aire y el agua permitirá que la planta de semillero una oportunidad de crecer a su mejor potencial. "Sustrato de crecimiento" también se conoce como tierra para macetas, tierra para macetas, la plantación de mezcla, o los medios de comunicación. Es esencial para que coincida con

Tipo correcto de sustrato

Estructura con contenedores específicos. Una bandeja plana o de semillas requiere un sustrato más pesado; Considerando que, una bandeja con pequeñas células en crecimiento requiere un sustrato ligero. El sustrato debe estar bien equilibrado y contienen ingredientes que proveen materiales absorbentes para la celebración de agua y adecuada porosidad para espacios de aire de modo que las raíces tendrá oxígeno adecuado.

El sustrato debe mantenerse amplio y luminoso en las planicies de las plántulas y las células debido al hecho de que la compactación del sustrato disminuirá la cantidad de espacio para el aire resultando así en el crecimiento de las raíces retraso en el crecimiento. Los productores que pre-llenar y apilar sus pisos y charolas deben incluir una capa de cartón entre los pisos para evitar la compactación. Es recomienda que los productores de llenar los pisos y las células de la parte superior; regadas una vez, lo harán reducir su volumen. El sustrato también tendrá que mantenerse estéril mientras se mezcla y durante

almacenamiento para prevenir la enfermedad de impactar las plántulas y el crecimiento del trasplante.

Las semillas necesitan la derecha, la cantidad de oxígeno y el agua antes de comenzar la germinación proceso. Las semillas empiezan mediante la absorción de agua, a continuación, enviar el radical que es el precursor de la raíz en el sustrato de crecimiento. Una vez que el radical entra en el crecimiento sustrato, el radical se convierte en una raíz, se desarrolla pelos radiculares y raíces secundarias y absorbe agua y nutrientes. Los cotiledones abrir tan pronto como el radical entra en el creciente sustrato, proporcionando una fuente de nutrientes para el radical hasta que el radical tiene desarrollado en una raíz que es capaz de absorber agua y nutrientes. En ese momento, el primeras hojas verdaderas emerge desde la punta del vástago y comenzar el proceso de fotosíntesis, la luz del sol para absorber, carbono e hidrógeno, que cambia en azúcares a promover el crecimiento de la planta y las raíces.

laura ortega torres

miércoles, 8 de febrero de 2012